El Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), que desarrolla en Galicia desde hace más de dos décadas una línea de investigación sobre mejora genética vegetal, avanza en la transformación genética de dos especies forestales, el alcornoque y la encina, con el fin de incrementar su tolerancia frente al hongo Phytophthora cinnamomi Rands, principal causante de la enfermedad conocida como “la seca”.
La mejora de la tolerancia a P. cinnamomi de alcornoque y encina se ha investigado en el marco de la tesis doctoral “Transformación genética del alcornoque y encina con una proteína tipo taumatina con actividad antifúngica”, realizada por la bióloga Vanesa Cano Lázaro en el grupo Biotecnología y Mejora Forestal del Instituto de Investigaciones Agrobiológicas de Galicia (IIAG) bajo la dirección de Elena Corredoira Castro.
La tesis, defendida recientemente en las instalaciones del citado instituto de investigación, ha obtenido la calificación de Sobresaliente cum laude. Se enmarca en el Programa de Doctorado en Avances en Biología Microbiana y Parasitaria.
La autora ha realizado la investigación con una beca predoctoral en el marco de los proyectos de investigación “Biotecnología aplicada a la propagación y mejora del alcornoque y la encina” y “Conservación y mejora del alcornoque y encina aplicando técnicas biotecnológicas”, financiados por la convocatoria Retos de Investigación del Plan Estatal de Investigación Científica y Técnica.
La tesis: objetivo y resultados
“El alcornoque y la encina son importantes componentes de las dehesas, modelos agrosilvopastorales únicos del sistema agroforestal del suroeste de la Península Ibérica y tienen una gran importancia económica y ecológica. Ambas especies se encuentran seriamente afectadas por la enfermedad de “la seca”, causada, entre otros factores, por el oomiceto Phytophthora cinnamomi Rands. Hasta la fecha, las prácticas
agronómicas tradicionales no han sido efectivas para controlar esta infección”, explica Elena Corredoira Castro, directora de la tesis.
“Por ello, una alternativa para producir árboles tolerantes a la enfermedad podría ser la aplicación de un método biotecnológico como es la transformación genética. En ambas especies aún no se han identificado los genes específicos relacionados con la defensa al oomiceto, por lo que es necesario buscar otras opciones con las que inducir algún tipo de resistencia, siendo una posibilidad la transformación genética con proteínas relacionadas con la patogénesis (proteínas PR), dentro de las que destacan las tipo taumatina (TLP)”, explica Vanesa Cano Lázaro, la autora de la tesis.
En este contexto, el objetivo de esta tesis fue la transformación de embriones somáticos de alcornoque y encina con el gen CsTL1, que codifica una proteína tipo taumatina con actividad antifúngica in vitro y que había sido identificado por el grupo de la profesora Isabel Allona, catedrática de la Universidad Politécnica de Madrid, en cotiledones de castaño.
En las dos especies, se transformaron tres líneas embriogénicas diferentes que habían sido inducidas a partir de árboles adultos. Tras 14 semanas en cultivo, se evaluó la eficiencia de transformación y en ambas especies resultó ser dependiente del genotipo. La presencia de los transgenes se comprobó mediante PCR, y la expresión del gen CsTL1 se analizó mediante qPCRrt. En alcornoque se analizó la expresión de 18 líneas transgénicas, de las cuales 15 sobreexpresaron el gen CsTL1, lo que representa el 83,33%. En encina se analizaron 6 de las 11 líneas transgénicas obtenidas, de las cuales 4 sobre-expresaron el gen CsTL1, lo que representa el 66,67%.
Los porcentajes de conversión a planta fueron variables, pero en todas las líneas evaluadas se obtuvo la regeneración de las plantas y las plantas derivadas de las líneas transgénicas crecieron con normalidad, no mostrando diferencias morfológicas con respecto a las plantas derivadas de embriones no transformados.
La evaluación de la tolerancia de las plantas transformadas con el gen CsTL1 frente a la infección con P. cinnamomi se realizó mediante un ensayo in vitro. En alcornoque, cuatro de las ocho líneas transgénicas evaluadas sobrevivieron significativamente más tiempo que sus correspondientes controles, mientras que encina, los datos de supervivencia no fueron tan concluyentes, y sólo una de las cinco líneas infectadas tuvo un tiempo de supervivencia significativamente mayor que el control sin transformar. En las plantas de alcornoque se observó una buena correlación entre el nivel de expresión del gen y los días de supervivencia de las plantas, de manera que, en general, se observó una mayor supervivencia en las plantas con mayor expresión del gen CsTL1. Por el contrario, en las plantas transgénicas de encina no se observó esa correspondencia.
La autora
Vanesa Cano Lázaro (1988, Madrid) es licenciada en Biología por la Universidad Complutense de Madrid. En 2015 se incorporó al IIAG para realizar su tesis doctoral. Ha realizado una estancia de investigación en la Estación Fitopatológica de Areeiro para el aprendizaje de técnicas de expresión mediante PCR cuantitativa para determinar los niveles de expresión del gen en las líneas de alcornoque y encina y el manejo la cepa P. cinnamomi y aprendizaje de métodos de inoculación de la misma en las plantas transformadas.
Sus líneas de investigación versan sobre la transformación genética de embriones somáticos de alcornoque y encina, y la posterior proliferación de las líneas transgénicas mediante embriogénesis somática, con análisis de las mismas mediante PCR y PCR cuantitativa. También se ha evaluado la conversión a planta de dichas líneas y el establecimiento in vitro de cultivos de brotes axilares de ambas especies, con el fin último de enraizar dichos brotes y someterlos a los ensayos de tolerancia in vitro frente a P. cinnamomi. Paralelamente se estudió la posibilidad de crioconservar en nitrógeno líquido las líneas embriogénicas transgénicas de alcornoque y encina, y la conservación a medio plazo a cuatro grados de los brotes axilares de ambas especies.
Para incrementar la tolerancia de ambas especies frente a P. cinnamomi, se ha sobre-expresado el gen CsTL1, aislado de castaño europeo y que codifica una proteína tipo taumatina.